IF+TUNEL双染

【产品信息】

石蜡切片荧光tunel+免疫荧光双标实验步骤
1、 石蜡切片脱蜡至水：依次将切片放入二甲苯Ⅰ12min-二甲苯Ⅱ12min-无水乙醇Ⅰ6min-95%酒精6min-85%酒精6min-蒸馏水洗（冬天脱蜡时间稍微延长）。
2、 修复：组织切片置于盛满EDTA修复液（PH8.0）的修复盒中于微波炉内进行抗原修复，中火8min停火8min
中低火7min，此过程中应防止缓冲液过度蒸发，切勿干片。自然冷却后将玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。
3、 阻断内源性过氧化物酶：切片加上3%的双氧水，室温孵育25min，将玻片置PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。
4、 血清封闭:切片稍甩干后用组化笔在组织周围画圈（防止抗体流走），在组化圈内滴加3%BSA 均匀覆盖组织，室温封闭30min。
5、 加一抗：切片稍甩干后用在圈内滴加按一定比例稀的抗体覆盖组织。切片平放于湿盒内4°C孵育过夜。
6、 加二抗：玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后在圈内滴加与一抗相应种属的二抗覆盖组织，避光室温孵育50min。
7、 信号放大:将玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min 。滴加相对应颜色Flare信号放大试剂，3-5min.将玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min 。
8、 修复：组织切片置于盛满EDTA修复液（PH8.0）的修复盒中于微波炉内进行抗原修复，中火8min停火8min中低火7min，此过程中应防止缓冲液过度蒸发，切勿干片。自然冷却后将玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。
9、 加试剂tunel工作液：按片子数量和组织大小取tunel试剂盒内适量试剂TdT酶和反应液试剂1:50混合，加到圈内覆盖组织，切片平放于湿盒内，37℃恒温箱孵育1.5小时，湿盒内加少量水保持湿度。
10、DAPI复染细胞核：切片用PBS（PH7.4）洗涤3次，每次5min。去除PBS后在圈内滴加DAPI染液，避光室温孵育
10min。
11、封片：玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后用抗荧光淬灭封片剂封片。
12、 镜检拍照：切片于尼康倒置荧光显微镜下观察并采集图像。（紫外激发波长330-380nm，发射波长420nm；
FITC绿光激发波长465-495nm，发射波长515-555 nm；CY3红光激发波长510-560，发射波长590nm）