| 产品目录 | 主要成分 | 产品规格 |
| HKW2019-1 | BCA 试剂 | 100mL |
| HKW2019-2 | 硫酸铜溶液 | 3×1.2mL |
| HKW2019-3 | 蛋白标准品（BSA） | 3×25mg |
| HKW2019-4 | 蛋白标准配制液 | 3×1.2mL |
【产品简介】
BCA 法定量检测蛋白的基本原理是基于双缩脲反应，即在碱性条件下，Cu2+被蛋白质还原 成 Cu+，随后 Cu+与 BCA (Bicinchonic acid， 一种显色剂) 发生螯合反应，每两分子 BCA 螯 合一个 Cu+，生成紫色的水溶性复合物，该物质在 562 nm 处有最高吸收值，且颜色深浅与蛋 白质浓度一定范围内成正比，因此可用于蛋白质的定量检测，蛋白浓度在 50-2000 μg/mL 浓 度范围内有较好的线性关系。
本方法不受绝大部分样品中化学物质的影响，可以兼容样品中高浓度的去垢剂，包括浓度 高达 5%的 SDS，5%的 Triton X-100，5%的 Tween-20、60、80 等。但螯合剂和高浓度还原剂 会影响检测结果，需确保样品中无 EGTA，EDTA 浓度低于 10 mM，DTT 低于 1 mM， β-巯基乙 醇低于 1 mM。【储存与运输】
冰袋运输；蛋白标准品 (BSA) 4℃保存，有效期 12 个月。配制成的蛋白标准溶液后需 -20℃ 保存，并在 6 个月内使用。其余试剂常温保存，有效期 12 个月。
【使用方法】
1. 配制蛋白标准贮备液：取 1 mL 蛋白标准配制液加入到蛋白标准品 (BSA) 蛋白标准管
中，将 25 mg 蛋白标准品完全溶解，即得到浓度为 25 mg/mL 的蛋白标准贮备液。配制成的蛋 白标准溶液可-20℃ 长期保存。
2. 配制蛋白标准工作液：取适量 25 mg/mL 蛋白标准贮备液，用 PBS 或生理盐水稀释 50
倍，得到终浓度为 0.5 mg/mL 的蛋白标准工作液。注意稀释时按照 10 倍梯度方法稀释，确保 稀释准确。
3. 绘制标准曲线 (酶标仪法) ：将蛋白标准工作液分别按 0，1，2，4，8，12，16，20 μ L 加到 96 孔 板中，然后用 PBS 或生理盐水依次加 20，19，18，16，12，8，4，0 μL 将上 述梯度工作液补足到 20 μL。得到蛋白浓度依次为 0，25，50，100，200，300，400，500 μ g/mL 的梯度曲线。
4. 准备待测样品：将待测的蛋白样品进行适当稀释 (可通过预实验检测，使样品蛋白浓度 在标准曲线范 围内，确保检测结果可信) ，按照每个样品 20 μL 的量加到 96 孔板中。待测 样品与蛋白标准品用相 同溶液稀释。
5. 配制 BCA 显色工作液：将 BCA 试剂与硫酸铜溶液按照 50:1 体积比充分混合均匀， 得到 BCA 显色工作液。BCA 显色工作液可室温保存，24 h 内使用。每个待测样品需 200 μL ，建议按需配制，避免浪费。
6. 检测：向标准曲线样品孔及待测样品孔中每孔加入 BCA 显色工作液 200 μL，充分混 匀 (可将 96 孔板放在振荡器上振荡 30 s) ，37℃反应 30 min 后，以标准曲线 0 号做参比 ，在 562 nm 波长下比色测定， 记录各孔吸光度值。 (注：也可以在室温反应 2 h，或 60℃ 反应 30 min。如果蛋白浓度较低，建议置 于 60℃反应)
7. 计算：以标准曲线中梯度蛋白含量 ( μg/mL) 为横坐标，吸光值为纵坐标，绘出标准 曲线。根据所测 样品的吸光值，在标准曲线上即可查得相应孔中待测样品的蛋白浓度 ( μg/mL ) ，再乘以样品稀释倍数即为待测样品实际蛋白浓度。议按需配制，避免浪费。
【注意事项】
1.BCA 法测定蛋使用 BCA 蛋白测定法测定时颜色会随着时间的延长不断加深，并且显色 反应的速度和温度有关，因此需注意保持定时和定温，以确保精确定量，若显色反应时间和温 度无法精确控制，宜每次都做标准曲线。
2.在进行蛋白标准贮备液的配制时，需确保溶解充分。稀释配制蛋白标准工作液时建议 10 倍梯度稀释， 不要一次稀释 50 倍，以免产生较大误差。
3.低温或长期保存，若发现 BCA 试剂 A 或者试剂 B 有沉淀发生。请 37ºC 温育并伴随搅 拌促使其充分溶解。如发现细菌污染，则应舍弃，避免对实验结果造成影响。
4. 操作时请穿实验服，并佩戴一次性手套。
杭州浩克生物
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